مکانیسم اثر بازدارندگی ناتامایسین وابسته به استرول موجود در غشای سلولی قارچ ها ، مخمر ها و کپک ها است و فقط باکتری هایی که در غشاء خود استرول داشته باشند نسبت به بازدارندگی ناتامایسین پاسخگو می باشند که تعداد این باکتری ها بسیار محدود می باشد.
نقطه هدف ناتامایسین ارگسترول در دیواره سلولی می باشد. ارگسترول یک سد ساختمانی در برابر کپک و مخمر در دیواره سلولی به وجود می آورد که مسئول نقل و انتقال مواد غذایی در درون سلول می باشد و به همین دلیل برای بقای کپک و مخمر مهم می باشد .